CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已廣泛應用于多物種、多領(lǐng)域的研究,使細胞和生物體的基因組編輯更加高效。將sgRNA送入細胞的傳統方法是通過(guò)質(zhì)粒轉染和慢病毒感染,兩者都存在基因插入和免疫反應的風(fēng)險。目前,將Cas9和sgRNA形成的核糖核蛋白(RNP)直接轉移到細胞中的方法具有更安全、更快速、脫靶效應更低、編輯效率更高的優(yōu)點(diǎn)。這已逐漸成為使用 CRISPR/Cas9 技術(shù)的一種更有效的方式。

泓迅科技專(zhuān)業(yè)的合成技術(shù)可提供基于化學(xué)合成及體外轉錄兩種策略的sgRNA合成服務(wù),為基因編輯實(shí)驗者提供多樣的解決方案。

· CRISPR-Cas9 sgRNA化學(xué)合成

使用化學(xué)合成策略的sgRNA合成服務(wù)提供100%正確的序列和所需的化學(xué)修飾,合成的sgRNA穩定性高,毒性低,編輯效率高。

圖1. Cas9-sgRNA復合物 圖2. sgRNA的二級結構


服務(wù)優(yōu)勢

  1. 高效:對sgRNA進(jìn)行化學(xué)修飾,提高體內的穩定性和編輯效率。
  2. 良好的穩定性:規范的質(zhì)量控制,確保批次間的一致性和可追溯性。
  3. 安全:避免將外源DNA整合到細胞和免疫反應中的風(fēng)險。
  4. 方便:sgRNA包含crRNA和tracrRNA的序列和功能,無(wú)需退火。

服務(wù)詳情

長(cháng)度(nt) 合成規格(OD) 修飾 純化方法 服務(wù)周期
95-105 1-10 2’-OMe
Phosphorothioate
HPLC 7-10個(gè)工作日

交付內容

  1. 凍干RNA
  2. COA文件

· CRISPR-Cas9 sgRNA 體外轉錄

泓迅科技還可提供從sgRNA DNA模板合成、sgRNA體外轉錄及純化一整套服務(wù),為客戶(hù)提供可轉入動(dòng)物細胞并直接發(fā)揮作用的sgRNA產(chǎn)品。目前,體外轉錄的sgRNA已成功的對斑馬魚(yú)、小鼠以及絲狀真菌等物種中的基因進(jìn)行了準確的編輯。

服務(wù)優(yōu)勢

  1. 一站式服務(wù):可以提供從sgRNA靶位點(diǎn)設計到高純度sgRNA獲取的全部過(guò)程。
  2. 周期短:最快3個(gè)工作日交付產(chǎn)量可達20 μg。
  3. 方便快捷:sgRNA可直接注射或轉染細胞進(jìn)行基因編輯實(shí)驗。

服務(wù)詳情

服務(wù)名稱(chēng) 產(chǎn)品/服務(wù)內容 交付項目
CRISPR sgRNA合成 sgRNA設計
DNA模板合成
體外轉錄sgRNA及純化
sgRNA和COA文件

IVT CRISPR-Cas9 sgRNA合成泓迅案例:

泓迅科技CRISPR-Cas9 sgRNA設計中心針對小鼠的多個(gè)基因各設計了8個(gè)sgRNA,然后進(jìn)行體外sgRNA轉錄實(shí)驗,實(shí)驗周期短至2天,sgRNA制備量為10-20ug,可以極快地滿(mǎn)足相關(guān)細胞學(xué)實(shí)驗的一般需求。

實(shí)驗流程:

一步法合成gRNA DNA模板

一步法合成gRNA DNA模板

grna-dna

實(shí)驗結果:

  1. 將gRNA DNA模板平連至pUC57載體測序,比對結果與設計序列一致。如圖1所示。
  2. 圖1.平連結果與設計序列比對圖

    圖1.平連結果與設計序列比對圖

  3. 將通過(guò)體外轉錄得到的sgRNA在2%的瓊脂糖中進(jìn)行電泳,可以看到清晰條帶。如圖2所示。
  4. 圖2. sgRNA瓊脂糖凝膠電泳圖

    圖2. sgRNA瓊脂糖凝膠電泳圖

  5. 我們對其中一條sgRNA序列進(jìn)行驗證,首先將sgRNA逆轉錄獲得cDNA,設計sgRNA擴增引物,經(jīng)過(guò)PCR反應獲得sgRNA的DNA序列;其次將DNA序列平連至pUC57載體進(jìn)行測序,結果顯示sgRNA序列正確。如圖3所示。
  6. 圖3. sgRNA序列驗證瓊脂糖凝膠電泳圖

    圖3. sgRNA序列驗證瓊脂糖凝膠電泳圖

    注:1PCR結果的模板是sgRNA 逆轉錄cDNA;2PCR結果的模板是經(jīng)DNaseI處理的sgRNA;3PCR結果的模板是體外轉錄的DNA模板

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參考文獻:

[1]Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity [J]. Science. 2012,337(6096):816-821.
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[3]Fujii W, Kawasaki K, Sugiura K, Naito K. Efficient generation of large-scale genome-modified mice using gRNA and CAS9 endonuclease [J]. Nucleic Acids Res. 2013,41(20):e187.
[4]Liu R, Chen L, Jiang Y, Zhou Z, Zou G. Efficient genome editing in filamentous fungus Trichoderma reesei using the CRISPR/Cas9 system. Cell Discovery. 2015.7.