一、載體概述

載體

將目的基因(DNA片段)轉入目標細胞、組織或生物體中以實(shí)現基因克隆、表達、編輯等一系列功能研究,該方法是生物領(lǐng)域最常用的一種研究方法。在基因工程領(lǐng)域,為避免目的基因DNA片段序列的降解同時(shí)保證功能有效性,在轉入細胞、組織或生物體之前,需要先通過(guò)基因工程技術(shù)將目的基因構建在一類(lèi)具有在宿主細胞內進(jìn)行自主復制能力的DNA分子上,該類(lèi)運輸工具被稱(chēng)為載體(Vector)。其中,工程化的質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體。

質(zhì)粒載體

質(zhì)粒是生物細胞內固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并被穩定遺傳的一類(lèi)核酸分子,常見(jiàn)于原核細菌及真菌中。絕大多數的質(zhì)粒是DNA型的,少部分為RNA型。天然DNA質(zhì)粒大都具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結構,具有分子量大、拷貝數低、單一酶切位點(diǎn)少等特點(diǎn)。通過(guò)對天然質(zhì)粒進(jìn)行元件添加、優(yōu)化等工程化改造,將其轉換成基因工程中最常用的載體,也稱(chēng)為質(zhì)粒載體。

功能特點(diǎn):
  ? 載裝能力:具有外源基因插入位點(diǎn),外源基因插入該位點(diǎn)后不會(huì )破壞質(zhì)粒載體的功能。
  ? 運輸能力:將目標基因轉入細胞。
  ? 復制或整合能力:為目標基因提供復制能力或整合能力。
  ? 具有擴增或表達能力:為目標基因的擴增或表達提供必要條件。
  ? 具有篩選標記。
  ? 具有不相容性:含有相同Ori的2個(gè)不同的質(zhì)粒不能同時(shí)存在于1個(gè)細胞中。
基本組成元件:
 ?。?)復制起始點(diǎn)(Ori):一段富含AT和重復序列的特定序列,通過(guò)招募復制相關(guān)蛋白啟動(dòng)質(zhì)粒復制。Ori決定了質(zhì)粒在宿主中的拷貝數,高拷貝質(zhì)粒(10-60個(gè)拷貝)被稱(chēng)為松弛型復制質(zhì)粒;低拷貝質(zhì)粒(1-3個(gè)拷貝)被稱(chēng)為嚴緊型復制質(zhì)粒,通常適用于毒性基因及大片段基因的克隆。只有1個(gè)Ori,表示是原核的克隆或表達質(zhì)粒;有2個(gè)Ori,則表示該質(zhì)粒是穿梭質(zhì)粒,即可在原核也可在真核中復制。注意:具有相同的ori的質(zhì)粒具有不相容性,不可共轉染。
 ?。?)抗性篩選基因(R):即抗生素抗性基因,方便后續通過(guò)抗生素篩選陽(yáng)性克隆。一般克隆發(fā)載體只有1種抗性篩選標記,部分穿梭質(zhì)粒具有2種抗性篩選標記。注意:原核生物和真核生物中的篩選基因不完全一致,原核生物中常見(jiàn)的有Ampr、Camr、Kanr、Tetr等;真核生物中常見(jiàn)的有Puro、G418、Hygr;原核和真核都可以的篩選基因有Zeocin、Blasticidin。
 ?。?)多克隆位點(diǎn)(MCS):即多個(gè)限制性?xún)惹忻该盖形稽c(diǎn)匯集序列區,其中的每個(gè)酶切位點(diǎn)在整個(gè)質(zhì)粒載體中只有一個(gè)。MCS區是外源基因的插入位點(diǎn),一般位于啟動(dòng)子與轉錄終止信號元件之間。不同載體,MCS所包含的限制性?xún)惹忻阜N類(lèi)、數目不同。注意:插入基因序列過(guò)長(cháng)會(huì )導致質(zhì)粒載體轉化效率變低。
 ?。?)啟動(dòng)子(P):通過(guò)與RNApol特異型結合,啟動(dòng)下游DNA轉錄的一段DNA序列,本身不被轉錄。啟動(dòng)子決定基因表達的細胞類(lèi)型及表達量。根據在細胞中啟動(dòng)表達的形式不同,分為3類(lèi):組成型/廣譜型啟動(dòng)子,組織/細胞基因特異性啟動(dòng)子,誘導表達啟動(dòng)子。
 ?。?)增強子(Enhancer):一種增強鄰近基因轉錄過(guò)程的順式作用元件,無(wú)方向性。
 ?。?)核糖體識別位點(diǎn)(RBS):位于mRNA的起始密碼子(AUG)上游,核糖體可以識別、結合這段序列并向下尋找ATG以起始蛋白翻譯。在原核生物中表達載體上的RBS為SD序列(位于A(yíng)UG前面);在真核生物中,主要依賴(lài)于mRNA的5’端帽子結構,除此之外,IRES元件和2A多肽元件也可作為RBS以啟動(dòng)蛋白表達。
 ?。?)轉錄終止子(Terminator):位于待轉錄基因下游的3’端調控元件之后,主要為多聚腺苷酸化或聚(A)信號,具有終止轉錄功能。原核生物主要為polyA;真核生物如哺乳動(dòng)物常見(jiàn)的終止子(SV40 polyA、hGH polyA、BGH polyA和rbGlob)包括促進(jìn)聚腺苷酸化和終止的序列基序AAUAAA。
 ?。?)引物結合位點(diǎn)(PBS):一段短的單鏈DNA序列,可以與PCR擴增或測序的引物結合,主要用于質(zhì)粒序列的人工檢測。注意:該類(lèi)位點(diǎn)可以根據應用進(jìn)行靈活設計。

二、質(zhì)粒載體分類(lèi)

質(zhì)粒載體將目的基因導入宿主細胞,進(jìn)而實(shí)現基因功能表達,這些載體在分子生物學(xué)研究中發(fā)揮著(zhù)至關(guān)重要的作用,是推動(dòng)合成生物學(xué)、生物醫藥、基因治療、靶點(diǎn)藥物篩選及農業(yè)生物技術(shù)等領(lǐng)域發(fā)展的基礎。根據質(zhì)粒載體的多樣化應用,其分類(lèi)也是多樣化的,主要有以下幾種:

1、按照屬性質(zhì)粒載體可分為:病毒載體非病毒載體。其中,病毒載體是一種利用病毒作為基因傳遞的載體,通常通過(guò)將外源基因插入或替換病毒基因組的方式,將所需的基因輸送至目標細胞中。病毒載體具有高度傳染性和特異性,能夠在宿主細胞中高效地傳遞和表達外源基因。

病毒載體的應用:

 ?。?)基因治療:利用病毒載體將治療性基因導入到目標細胞中,用于治療遺傳性疾病、癌癥等疾病。
 ?。?)基因編輯:利用病毒載體將基因編輯工具(如CRISPR/Cas9系統)輸送至目標細胞中,實(shí)現基因組的精準編輯和修飾。
 ?。?)疫苗開(kāi)發(fā):利用病毒載體作為疫苗遞送平臺,輸送目標抗原基因至免疫細胞中,誘導免疫反應,從而產(chǎn)生保護性免疫應答。
 ?。?)基因研究:在基因功能研究、蛋白質(zhì)表達和藥物篩選等領(lǐng)域,病毒載體用于將特定基因傳遞到細胞或動(dòng)物模型中,研究其功能和作用機制。

病毒載體分類(lèi)及比較如下:

載體類(lèi)型 定義 特點(diǎn) 優(yōu)勢 限制
慢病毒( LV)載體 一種基于慢病毒(如人類(lèi)免疫缺陷病毒HIV-1)的基因傳遞系統,去除了病毒的復制和致病基因,慢病毒載體保留了病毒將遺傳物質(zhì)整合到宿主細胞的基因組中特性。 1、整合能力:可將外源基因整合進(jìn)宿主細胞的染色體DNA中。
2、宿主范圍廣:對分裂細胞和非分裂細胞都有感染能力。
3、可穩定性表達。
載荷容量較大:適用于攜帶較大基因片段或多個(gè)基因的轉導。 潛在致癌風(fēng)險:基因整合可能導致插入突變,增加致癌風(fēng)險。
腺病毒載體 一種基于腺病毒(Adenovirus)的基因轉移工具,腺病毒是一種無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒,能夠在非分裂的細胞中高效地表達外源基因,不整合到宿主細胞基因組中,適合短期表達。 1、非整合能力。
2、感染范圍廣:能夠感染包括分裂細胞和非分裂細胞在內的廣泛宿主細胞。
3、瞬時(shí)表達。
1、高效感染:能夠在短時(shí)間內感染大量細胞。
2、安全性高:腺病毒載體不整合到宿主細胞染色體中,無(wú)插入致突變性。
3、高滴度:腺病毒載體可產(chǎn)生高滴度的病毒液,有利于大規模制備和應用。
1、瞬時(shí)表達:外源基因表達持續時(shí)間較短,需要多次接種以達到治療效果。
2、免疫反應風(fēng)險:腺病毒具有較強的免疫原性,可能引發(fā)宿主細胞的免疫反應和炎癥反應,影響治療效果。
腺相關(guān)病毒(AAV)載體 一種基于腺相關(guān)病毒(Adeno-Associated Virus, AAV)的基因轉移工具,AAV是一種小的、非包膜的單鏈DNA病毒,它與多種腺病毒有關(guān),但與腺病毒不同,AAV本身不會(huì )引起疾病,因此在作為基因載體時(shí)具有很高的安全性。 1、小型單鏈DNA病毒:基因組DNA<5 kb,無(wú)包膜。
2、非致病性:AAV自然存在于人類(lèi)中,但并不會(huì )導致任何已知的疾病。
1、安全性高:AAV不會(huì )破壞宿主細胞的基因組,不會(huì )引起明顯的免疫反應或病理反應。
2、可長(cháng)期表達:AAV可以在宿主細胞中長(cháng)期表達外源基因。
3、靶向性:AAV有多種血清型,不同的AAV血清型可以靶向不同的細胞和組織。
1、載體容量有限:AAV的基因組較小,能夠攜帶的外源基因序列長(cháng)度有限,通常不超過(guò)4.5 kb。
2、免疫原性:雖然AAV的免疫原性較低,但在部分人群中仍可能引起免疫反應。
3、制備成本高:AAV的制備過(guò)程較為復雜,成本較高。
逆轉錄病毒載體 一種利用逆轉錄病毒作為遞送系統的基因轉移工具,逆轉錄病毒載體通常來(lái)源于能夠將RNA逆轉錄成DNA的病毒,如人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)經(jīng)過(guò)改造后的形式。 1、RNA病毒:逆轉錄病毒是一種單鏈RNA病毒,其基因組以RNA形式存在。
2、逆轉錄機制:逆轉錄病毒利用逆轉錄酶將其RNA基因組逆轉錄為DNA,并整合到宿主細胞基因組中。
1、穩定表達:由于整合到宿主基因組,逆轉錄病毒載體可以實(shí)現長(cháng)期的基因表達。
2、較大基因載量:逆轉錄病毒能夠攜帶較大的外源基因序列,通??蛇_8-10 kb。
3、感染效率高:逆轉錄病毒載體可以感染多種類(lèi)型的細胞,包括一些難以轉染的細胞類(lèi)型。
4、技術(shù)成熟:逆轉錄病毒載體技術(shù)相對成熟,有多種載體和包裝系統可供選擇。
1、整合位點(diǎn)不確定性:逆轉錄病毒隨機整合到宿主基因組中,可能引起插入突變,導致基因組不穩定性和潛在的致癌風(fēng)險。
2、主要感染分裂細胞。
3、潛在的免疫反應:盡管逆轉錄病毒通常不會(huì )引起強烈的免疫反應,但在某些情況下仍可能引發(fā)宿主免疫系統的反應。

 

2、按照進(jìn)入受體細胞的類(lèi)型不同可分為原核載體、真核載體和穿梭載體(即可以存在于原核細胞,又可存在于真核細胞)。

3、按照Ori元件不同可分為高拷貝質(zhì)粒和低拷貝質(zhì)粒。

4、按照載體性質(zhì)不同可分為融合型載體和非融合型載體。融合型載體能夠將外源基因整合進(jìn)宿主細胞的基因組實(shí)現外源基因在宿主細胞中的穩定表達,又稱(chēng)為穩定型表達載體;非融合型載體裝載著(zhù)目標基因以游離的形式存在于細胞中,使得目標基因在宿主細胞中的短暫表達,又稱(chēng)為瞬時(shí)表達載體。

瞬時(shí)表達載體與穩定性表達載體比較如下:

質(zhì)粒類(lèi)型 工作原理 導入細胞方法 特點(diǎn) 優(yōu)勢 限制 應用
瞬時(shí)表達載體 游離于細胞中,帶動(dòng)目標基因在短時(shí)間內快速表達并達到高峰,隨后逐漸降低。 病毒包裝、化學(xué)試劑、電穿孔等。 篩選標記基因是非必須元件;
表達快速、操作簡(jiǎn)單。
表達快速、操作簡(jiǎn)單、靈活、成本低 1、可能觸發(fā)細胞防御機制,導致基因沉默;
2、高效表達可能會(huì )對細胞產(chǎn)生毒性;
3、表達非永久且不穩定。
快速分析基因的功能或蛋白活性。
穩定表達載體 將目標基因整合在宿主細胞基因組后使得目標基因持續且穩定性表達。 病毒包裝、化學(xué)試劑、電穿孔等 篩選標記基因是必須元件;
持續穩定表達
長(cháng)期穩定表達、表達水平可控、遺傳穩定性、安全性高、可重復性好 1、轉化效率低;
2、細胞篩選周期長(cháng)、成本高;
3、轉染/轉化條件苛刻
在基因工程、細胞生物學(xué)及醫學(xué)等領(lǐng)域應用廣泛,如重組蛋白生產(chǎn)、基因功能研究、基因治療藥物開(kāi)發(fā)等。

 

5、按照功能不同可分為克隆載體、表達載體、基因編輯載體、表達調控載體、體外轉錄載體及功能檢測載體等。

克隆載體career_open

表達載體career_open

編輯載體career_open

表達調控載體career_open

體外轉錄載體career_open

啟動(dòng)子功能檢測載體career_open

蛋白互作檢測載體career_open

相關(guān)服務(wù)

基因合成
代謝通路合成與文庫組裝
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重組膠原蛋白基因合成
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質(zhì)粒制備

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