利用CRISPRi技術(shù)調控基因表達

【背景】

CRISPRi技術(shù)是在CRISPR-Cas9基礎上,將Cas9蛋白改造成為不具有切割活性的dCas9,在sgRNA的介導下仍可以靶向基因組序列。CRISPRi技術(shù)能夠有效的抑制編碼基因和非編碼基因的表達,并可同時(shí)對多個(gè)基因進(jìn)行調控且無(wú)脫靶率。CRISPRi技術(shù)的出現為研究基因的功能提供了高效的新方法。

【方法】

設計dCas9結構包括兩個(gè)突變體RuvC1-和HNH-。sgRNA包含三個(gè)部分:20nt用于與匹配目標序列,42nt用于與Cas9結合,40nt為轉錄終止結構。針對mRFP基因編碼序列不同區域設計sgRNA,用于檢測dCas9能否高效抑制基因表達。

【結論】

  1. CRISPRi技術(shù)能夠抑制轉錄起始和延伸,靶向非模板鏈DNA的dCas9-sgRNA會(huì )產(chǎn)生有效的沉默;靶向模板鏈DNA的dCas9-sgRNA效果不明顯,dCas9-sgRNA結構靶向啟動(dòng)子區域能夠造成有效的基因沉默;
  2. CRISPRi基因抑制過(guò)程是可逆的。 dCas9-NT1受 aTc啟動(dòng)子控制,隨著(zhù)時(shí)間的延長(cháng),mRFP蛋白熒光量先降后升,最后會(huì )恢復到與陽(yáng)性對照相同的水平,由此說(shuō)明CRISPRi基因敲除是一個(gè)可逆的過(guò)程;
  3. 在目標位點(diǎn)上游轉錄暫停,暫停位點(diǎn)與目標位點(diǎn)之間長(cháng)度為19bp堿基,由此得知CRISPRi通過(guò)抑制轉錄過(guò)程對基因表達進(jìn)行調節;
  4. CRISPRi sgRNA沉默是高特異性的,對全基因組范圍內的mRNA序列測序得知,sgRNA(NT1)靶向mRFP基因后,mRFP基因是唯一轉錄豐度降低的基因,沒(méi)有其他基因顯示出明顯的基因表達量的變化;
  5. CRISPRi能夠同時(shí)調節多個(gè)基因,設計兩個(gè)sgRNA分別靶向mRFP基因和sfGFP基因,CRISPRi系統可將兩個(gè)基因同時(shí)敲除,由此說(shuō)明CRISPRi系統可以同時(shí)對多基因進(jìn)行調節;
  6. 決定CRISPRi沉默效率的因素:sgRNA長(cháng)度、與目標序列的重合度以及sgRNA的位置CRISPRi抑制的效果與目標位點(diǎn)與起始位點(diǎn)之間的距離呈反比例相關(guān),一般情況下,sgRNA與基因組序列有20bp重復序列用于靶向目標序列,而通過(guò)實(shí)驗數據可以得知基因沉默所需匹配序列的最短長(cháng)度是12bp;sgRNA的最初7nt堿基區域對于基因沉默具有重要作用;使用兩個(gè)sgRNA靶向同一個(gè)基因,可以提高CRISPRi的效率,但是,如果兩個(gè)sgRNA具有重疊效應時(shí),可能會(huì )降低CRISPRi的效率;
  7. CRISPRi技術(shù)可應用于內源性的基因網(wǎng)絡(luò )。針對大腸桿菌乳糖表達途徑上的相關(guān)基因設計sgRNA,結果可以得知,LacZ基因的表達量受到抑制,而LacI基因則被激活,表達量有所增加。由此說(shuō)明CRISPRi技術(shù)可以提供一個(gè)快速、有效的方法來(lái)驗證基因網(wǎng)絡(luò )中各個(gè)基因的功能;
  8. CRISPRi技術(shù)在人類(lèi)細胞中也同樣適用,可對人類(lèi)HEK293細胞系中的基因表達造成抑制。

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參考文獻
Qi, L.S., et al., Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell, 2013. 152(5): p. 1173-83.